PPB即表示與血漿蛋白結合形成結合態(tài)藥物的比例。游離藥物假說認為僅有游離態(tài)的藥物才能擴散透過生物膜，到達靶部位發(fā)揮藥效；另外游離藥物的比例還顯著影響藥物分布、代謝和排泄的過程，PPB與藥物的諸多藥理性質均有關。

　　影響PPB測定的因素很多，如溶解度、溫度、非特異性結合、酯酶代謝等，需根據(jù)化合物的特征，結合研究的實際目的，選擇合適的測定方法反應真實的化合物特性。需根據(jù)化合物預期治療濃度，個性化的制定試驗濃度，必要時進行不同濃度條件下的PPB測定。其中對于*蛋白結合率的化合物，試驗的微小偏差即會對結果造成較大的相對偏差，此時還需要同步優(yōu)化精密度更高的LC-MS/MS、放射性等檢測分析技術。

　　平衡透析法目前是常用的方法，但也存在一定的缺陷，如初始平衡狀態(tài)的改變、非特異性結合、體積變換、Donnan效應和蛋白滲漏等。

　　初始平衡狀態(tài)的改變是指當游離藥物穿過半透膜時會形成新的游離態(tài)-結合態(tài)的平衡，由此造成試驗設置濃度與實際平衡濃度的差異，對于PPB存在濃度依賴特性的化合物可能造成結果的偏差。

　　非特異性結合是指藥物與半滲透膜等試驗裝置的結合，可能造成游離藥物濃度的低估，進而影響試驗結果。通常采用聚四氟乙烯(Teflon)制造的試驗裝置以降低非特異性結合的影響。如果非特異性結合現(xiàn)象比較嚴重建議采用超速離心法。

　　體積轉換是指液體在膠體滲透壓的作用下從buffer側移動至蛋白側，由此稀釋蛋白濃度對結合率較低的化合物試驗結果造成影響。當液體轉換比例低于10%時該效應幾乎忽略，孵育時間超過4h可能會加劇該效應，可以通過在buffer側加入右旋糖酐以平衡兩側滲透壓。

　　Donnan效應是指吉布斯-唐南效應，是指帶電粒子不通過半透膜而產(chǎn)生不均勻的電荷，使兩側粒子濃度不一致。尤其對于高離子化且低蛋白結合的藥物，該效應最為明顯，該效應可以通過增加buffer側電解質的濃度來弱化。

　　當半透膜完整性出現(xiàn)問題時會發(fā)生蛋白滲漏現(xiàn)象，對于高蛋白結合率化合物，由此會造成游離藥物比例的顯著高估，尤其在孵育時間過長時易發(fā)生。